Çin kuduz virüsü aşısı suşu 2aG4-B40 hücreye uyarlanmış 2BS’nin uygulama umutları | Viroloji Dergisi

hayvanlar

Tüm hayvan prosedürleri, Pekin Biyolojik Ürünler Enstitüsü Co., Ltd. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Deneyler için 3 ila 4 haftalık erkek fareler kullanıldı.

2BS hücre kültürü

İnsan diploid 2BS hücre dizisi, kürtajla alınan 3 aylık bir fetüsün akciğer dokusundan ekstrakte edildi ve 1974 yılında kuruldu. Hücre dizisi uzun bir yaşam döngüsüne sahiptir ve 66 nesil boyunca aktarılabilir. 2BS hücreleri, 6-8 gün boyunca %10 fetal sığır serumu (FBS) (HyClone, ABD) ile desteklenmiş DMEM’de kültürlendi. Daha sonra hücreler sindirildi ve transfekte edildi. Transfekte edilmiş hücreler kuduz virüsünü kültürlemek için kullanıldı.

Western blot analizi

Proteinler, buz gibi soğuk RIPA lizis tamponu kullanılarak kuduz virüsü örneklerinden ekstre edildi. Numunelerin toplam protein konsantrasyonları BCA tahlili (Pierce, ABD) ile ölçüldü. Proteinler daha sonra bir SDS‒PAGE jeli üzerinde ayrıldı ve Coomassie parlak mavisi ile boyandı veya PVDF membranlarına (Merck Millipore, Almanya) aktarıldı. Membranlar 1 saat boyunca %3 a/h sığır serum albümini ile bloke edildi ve daha sonra kuduz virüsü G proteinine (HyTest 3R7-4F1, Çin) karşı birincil antikorlarla gece boyunca 4°C’de inkübe edildi. 1x TBST ile yıkandıktan sonra membranlar, yaban turpu peroksidazına (Biodragon, Çin) konjuge edilmiş uygun bir kuduz virüsü IgG ikincil antikoru ile inkübe edildi. Western immünoblotlar, geliştirilmiş fotokimya (ECL) reaktifi kullanılarak görselleştirildi ve bir ChemiDoc XRS+ cihazı (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) kullanılarak değerlendirildi.

Kumasi’den parlak mavi boya

Protein içeren SDS‒PAGE jeli, bir protein boyama aparatına (eStain LI, Genscript) yerleştirildi. Jel, bir döngü boyunca 2 dakika boyunca Coomassie mavisi ile boyandı ve iki döngü boyunca renk giderici sıvı ile 2,5 dakika boyunca yıkandı.

Sekans

Nükleotid dizilimi allwegene Beijing (Pekin, Çin) tarafından gerçekleştirildi. Farklı geçiş sayılarına sahip virüslerden genomik RNA ekstrakte edildi ve DNA konsantrasyonu bir Qubit cihazı ile belirlendi. Kütüphane yapımı için Illumina V3 için VAHTSTM Evrensel DNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti kullanıldı. Kütüphanenin bir NextSeq550 cihazı (Illumina, ABD) kullanılarak sekanslanmasının ardından, kalite kontrolünden sonra temiz okumalar elde edildi ve referans genomu (aG suşu) ile derinlemesine karşılaştırmalı analiz gerçekleştirmek için bwa yazılımı (v0.7.17-r1198-dirty) kullanıldı. (GQ412744.1) ve karşılaştırma oranı ve kapsamı hesaplandı.

Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA)

Antijen seviyelerini ELISA ile değerlendirdik. aG suşuna karşı antikorlar sıçan serumundan ekstrakte edildi ve bir ELISA plakasını kaplamak için kullanıldı. aG suşuna karşı antikor, 96 oyuklu bir plakaya eklendi ve 37°C’de 1-2 saat süreyle inkübe edildi, ardından 4°C’de gece boyunca inkübe edildi. Ertesi gün, 96 oyuklu bir plaka 37°C’de 1 saat boyunca %3 BSA ile bloke edildi. Daha sonra hücreler eklendi ve 1 saat boyunca kültürlendi. Enzim etiketli antikorla 37°C’de 30 dakika inkübasyonun ardından, bir TMB çözeltisi ve sonlandırma çözeltisi sırayla ilave edildi. Her kuyucuğun absorbansı (OD değeri), 450 nm ve 630 nm dalga boylarında bir mikroplaka okuyucu ile ölçüldü ve nihai OD değeri, 630 nm absorbans değerinin 450 nm absorbans değerinden çıkarılmasıyla belirlendi.

Viral plakların oluşumu

2BS hücreleri altı oyuklu plakalara ekildi ve aynı anda 2BS hücrelerine uyarlanmış kuduz virüsü eklendi. Daha sonra 2BS hücreleri ve kuduz virüsü, gece boyunca %5 CO2 içeren 37°C’deki bir inkübatörde birlikte kültürlendi. Ertesi gün kültür solüsyonu atıldı, %0,5 metilselüloz ilave edildi ve kuduz virüsüyle enfekte olmuş 2BS hücreleri, 6 gün daha kültürlendi. Altı kuyulu plakalarda hücresel veya şüpheli lezyonlar görülebildiğinde lezyonun yeri belirlendi. Seçilen plaklar, 2BS hücre süspansiyonu içeren 96 oyuklu plakalara yerleştirildi ve 6 gün boyunca %5 CO2 ile 37°C’de bir inkübatörde kültürlendi. Üstteki sıvı daha sonra toplandı ve 2BS hücre süspansiyonu ile 24 oyuklu plakalara aktarıldı. 6 gün kültürlemenin ardından üstteki sıvı toplandı ve antijen içeriği tespit edildi. Yüksek antijen içeriğine sahip virüsler, 2BS hücreleriyle daha fazla ekim için seçildi. Virüsün adresi, yüksek antijen içeriğine sahip 3 nesil kuduz virüsünün 2BS hücrelerine uyarlanmasının ardından ortaya çıktı ve en yüksek adrese sahip virüs, daha fazla ekim için seçildi.

Kütle spektrometrisi

Kuduz virüsü örneklerinden proteinler ekstrakte edildi ve protein yapıları RapigestTM SF yüzey aktif madde (Waters Corporation, ABD) ile işleme tabi tutularak bozuldu. Daha sonra disülfit bağı DTT (EMD Millipore Corporation, ABD) tarafından açıldı ve ardından IAM (EMD Millipore Corporation, ABD) ile bloke edildi. Son olarak proteinler trypsin ile sindirildi ve reaksiyon formik asit ile sonlandırıldı. Peptit ayırma, bir Acquity Pertide BeyC18 kolonunda (Waters Corporation, ABD) gerçekleştirildi ve numuneler, bir Thermo Scientific Q Exactive Plus kütle spektrometresi ile toplandı. Toplanan veriler BioPharma Finder yazılımı kullanılarak analiz edildi. Düşük yanlılığa (delta ≤ 5 ppm), güven puanı 100’e ve ana ve kız iyonların tespitine sahip numuneler karşılaştırıldı.

Doğrudan floresan antikor testi

2aG4-B40’ın kuduz antijenlerini tanımlamak için doğrudan floresan antikor testi kullanıldı. BHK-21 hücreleri 96 oyuklu plakalara yerleştirildi ve tek bir katman oluşturmasına izin verildi. Daha sonra hücreler, 37°C’de 24 saat boyunca virüs (5 kat seyreltilmiş seri) ile enfekte edildi. Daha sonra hücreler buz soğukluğunda %80 asetonla sabitlendi ve FITC etiketli protein N izotiyosiyanatla boyandı. Plakalar floresan mikroskobu yoluyla gözlendi.

Virüs titrasyonu

Virüs konsantrasyonu, Çin Farmakopesinde belirtildiği gibi farelere intraserebral enjeksiyon yoluyla ölçüldü. Kısaca, 11 ila 13 g ağırlığındaki farklı gruplardaki (grup başına 6 fare) NIH farelerinin beyinleri, virüsün 10 kat seri seyreltilerinden 0,03 ml ile aşılandı ve aşılamadan sonraki üç gün içinde meydana gelen belirlenemeyen ölümler hariç tutuldu. Klinik semptomlar geliştiren ve 14 gün sonra ölen farelerin sayısı kaydedildi. Medyan öldürücü doz (LD50) ve virüs vektörleri Reed ve Munch yöntemi kullanılarak hesaplandı.

Kuduz virüsünü tanımlayın

2aG4-B40 suşunun spesifik özellikleri farelerde intraserebral nötralizasyon testiyle belirlendi. Virüs seri olarak 10 kat seyreltildi ve virüsün uygun seyreltmeleri kuduz immünoglobulin (nötralizasyon grubu) veya negatif serum (kontrol grubu) ile eşit miktarlarda karıştırıldı. 11-13 g ağırlığındaki NIH fare grupları (her grupta 6 fare), her seyreltmede 0.03 ml karışımla intraserebral olarak aşılandı ve aşılamadan sonraki üç gün içindeki belirsiz ölüm hariç tutuldu. Klinik semptomlar geliştiren ve 14 gün sonra ölen farelerin sayısı kaydedildi. Medyan öldürücü doz (LD50) ve virüs vektörleri Reed ve Munch yöntemi kullanılarak hesaplandı. Nötralizasyon indeksi, kontrol virüsünün adresinin tersi ile nötrleştirici virüsün adresinin çıkarılmasıyla elde edilen değerdir.

Deneysel aşı hazırlanması

Hasat edilen 2aG4-B40 suşları ilk önce 300 kDa ultrafiltrasyon membranlarında (Millipore Pellicon 2, ABD) konsantre edildi ve ardından kromatografik kolonlarda saflaştırıldı. Saflaştırılmış virüs, β-propanolakton ile etkisiz hale getirildi. Test aşısı daha sonra 200 mIU/mL antijen konsantrasyonunda saflaştırılmış virüsle formüle edildi. Test aşısı, bir vakumlu dondurma-kurutucuda (Shanghai Kyowa Vaccum Engineering Co., Ltd.) üç aşamalı bir dondurarak kurutma işlemi yoluyla uygun koruyucu maddelerle dondurularak kurutuldu: -40°C’de dondurma, -3’te birincil kurutma °C ve ikincil kurutma 28°C’de.

İmmünoloji çalışmaları

Temas öncesi profilaksi (PrEP) ve temas sonrası profilaksi (PEP), kuduzu önlemenin etkili yollarındandır. Böylece deneysel aşıların immünojenitesi, maruz kalma öncesi profilaksi (PrEP) ve maruz kalma sonrası profilaksi (PEP) yoluyla belirlendi.

PrEP aşılama rejimi, 0. ve 7. günlerde intraperitoneal enjeksiyon yoluyla uygulandı. Spesifik olarak, NIH farelerine (12-14 g), 0. ve 7. günlerde 0,5 ml test aşıları enjekte edildi. Negatif kontrol farelerine, 0,5 ml PBS enjekte edildi Aynı şekilde. Her iki fare grubuna da 14. günde intraserebral enjeksiyon yoluyla 10 kat seri seyreltmelerde standartlaştırılmış virüs (CVS suşu, 0.03 ml, doz başına 10 fare) uygulandı. Klinik semptomlar geliştiren ve 14 gün sonra ölen farelerin sayısı kaydedildi. Medyan öldürücü doz (LD50), Reed ve Muench yöntemi kullanılarak hesaplandı. Koruma indeksi, aşı grubu ile kontrol grubu arasındaki LD50 oranı olarak belirlendi.

Dünya Sağlık Örgütü’nün önerdiği gibi beş dozluk rejim (ESN, 1-1-1-1-1), kas içi maruziyet sonrası tedavi rejimlerinden biriydi. Farelerde kuduz virüsü nötralize edici antikorların (RVNA) konsantrasyonunu belirlemek için hızlı floresan odak inaktivasyon testi (RFFIT) kullanıldı. [24] 0, 7, 14, 28 ve 42. günlerde toplanan serum örneklerini değerlendirmek için kullanıldı.

Aşı gücü testi

Değiştirilmiş aşının farelerde enfeksiyona karşı koruyucu etkinliğini değerlendirmek ve bunu ulusal standart kuduz aşısıyla karşılaştırmak için tespit yöntemi olarak Ulusal Sağlık Enstitüleri testi (Şema) seçildi. Ulusal standart ve test aşılarının farklı dilüsyonları NIH farelerine (12-14 g, fare başına 0,5 ml, doz başına 10 fare) 0. ve 7. günde intraperitoneal olarak enjekte edildi. Daha sonra tüm farelere standartlaştırılmış virüs (CVS suşu, 0.03 ml) 14. günde intraserebral enjeksiyonla yapıldı. CVS suşu titrasyonu bu tahlil için vazgeçilmezdi. Ortalama etkili doz (ED50), Reed ve Munch yöntemi kullanılarak hesaplandı. Test aşılarının göreceli etkinliği, ulusal standardın ED50’si ile karşılaştırılarak elde edildi.

İstatistiksel analizler

İstatistiksel veriler ortalama ± SEM (ortalamanın standart hatası) olarak sunulmuştur. Tüm istatistiksel analizler için GraphPad Prism sürüm 9.0 kullanıldı. İki kuyruklu eşleştirilmiş öğrenci puanları kullanıldı T İki grubu karşılaştırmak için t testleri, ikiden fazla grup arasındaki farkları karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı. Tüm istatistiksel deneyler bağımsız olarak en az üç kez tekrarlandı. S< 0,05 istatistiksel anlamlılığın bir göstergesi olarak kabul edildi.